在ELISA实验中，样本测值偏低的现象可能由多种因素共同引起。除了一些常见问题如样本处理、试剂保存与操作规范外，假设实验操作完全正确、标准曲线表现良好，样本测值低的情况可以从两个方面进行分析：一方面是样本本身的含量能够被检测，但由于实验操作等因素使得测值未在ELISA试剂盒的范围内；另一方面则是分析物在样本中的浓度本身偏低。接下来将围绕这两个方面探讨导致样本测值低的因素及对应解决方案。

1. 样本本身的可检测含量

以下是一些导致样本测值低的主要原因：

(1) ELISA试剂盒的保存

ELISA试剂盒需按照规定方法进行保存，实验者在购买时应重视各组分的保存要求。

(2) 样本上样前的准备

这一过程包括样本的制备和保存，尤其要避免反复冻融。采用不同的制备方法来处理血清、血浆与细胞裂解液是至关重要的。一般建议在-20℃或-80℃条件下储存样本，储存时间也不宜过长，以免造成目标蛋白降解，影响检测结果。同时，应避免样本反复冻融。

(3) 稀释方案

样本的稀释对实验的成功至关重要，无论是过度稀释还是不足的稀释都可能导致测值偏低。过度稀释可能源于文献中的估算与实际样本之间的差异，建议在正式实验前先进行预实验以确定最佳稀释倍数。而对样本未充分稀释可能导致的假阴性反应也需通过预实验来解决。

2. 分析物在样品中浓度偏低

不少情况下，客户的操作无误、标准曲线良好，但多次检测样本仍不在检测范围。对于一些细胞因子如IL-6，通常需要在炎症刺激下大量产生，非炎症样本往往测值极低。因此，建议选择合适的样本类型，或使用更高灵敏度的试剂盒进行检测。

3. 常被忽视的关键干扰因素

以下细节常被忽略，却可能成为关键干扰因素：

1. 样本基质效应

某些生物样本（如血清、血浆）中的脂质、血红蛋白或异嗜性抗体可能非特异性结合捕获抗体，形成“隐形复合物”。建议通过1:2至1:5的梯度稀释样本测试OD值是否呈线性下降。如果稀释后测值异常升高，则说明存在基质干扰。此外，添加5%脱脂奶粉或0.1% Tween-20的封闭液，能够有效减少非特异性吸附。

2. 抗原表位构象变化

一些蛋白在长时间冻存或反复冻融后可能发生降解或聚集，导致ELISA抗体识别的表位受损。建议冻存超过3个月的样本重新采集，并避免使用EDTA抗凝管分装样本。对易降解靶标（如细胞因子）应在检测前加入蛋白酶抑制剂。

3. 酶标板边缘效应

实验人员经常忽视96孔板的外周孔与中心孔的温差，导致边缘孔液体蒸发、浓度升高，而中心孔反应不足。常见的解决方案是弃用边缘的12个孔，或改用预冷板架保持温度。

4. 标准品复溶误差

冻干标准品复溶时若未充分震荡（建议涡旋30秒后静置10分钟），可能造成局部浓度差异高达20%。建议使用纳米级滤膜过滤后分装，以避免反复冻融。

5. 仪器校准盲区

酶标仪光路系统每6个月需校准一次，尤其注意450nm与630nm双波长检测时的基线漂移。建议在每次实验前用空白孔进行动态范围测试。对于难以定位的异常低值，可以采用“反向加样法”验证，帮助判断样本是否存在抑制物或板间差异。

通过以上系统性的分析和排查，相信每位实验者都能有效提高ELISA检测的准确性。若需进一步探索生物医疗领域的创新技术和解决方案，欢迎访问尊龙凯时获取更多资源与支持。